Wirkung homöopathischer Arzneien wissenschaftlich bewiesen

Schlüsselwörter:

1. Einführung

Bei der Potenzierung handelt es sich um ein Verfahren, bei dem sukzessive Verdünnungen und Sukzessionen (kräftiges Schütteln) vorgenommen werden; es wurde erstmals von dem deutschen Arzt Samuel Hahnemann eingeführt, der feststellte, dass Lösungen von Substanzen, die diesen Prozess durchlaufen haben, beim Menschen eine biologische Wirkung haben – mit therapeutischem Nachweis [1]. Bis heute sind zahlreiche homöopathische Mittel verwendet worden, die sehr gut dokumentiert sind [2], [3], [4], [5], [6]; sie werden aus einer Vielzahl von Substanzen gewonnen, die potenziert werden, um ihre heilenden Eigenschaften zu erhalten. Mehrere aufschlussreiche Perspektiven haben versucht, die Wirkung von homöopathischen Mitteln zu erklären [7], [8], [9], [10], [11]. Der Einfluss der Sukkkussion (kräftiges Schütteln) auf einige pharmazeutische Zubereitungen wie Echinacea 10-2, Baptisia 10-3, Baptisia 10-4, Luffa 10-4 und Spongia 10-6 wurde kürzlich mit Hilfe der Tröpfchenverdunstung und statistischer Analysen beleuchtet; die Proben wurden nach den Regeln des Europäischen Arzneibuchs für homöopathische Arzneimittel hergestellt, und die Autoren verwendeten 0, 10 oder 100 Sukkzessionshübe. Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede für alle untersuchten Präparate [12]. Darüber hinaus sind die Auswirkungen mechanischer Schocks (d. h. Schütteln, Fallenlassen) auf Proteinlösungen wohl bekannt, und in einigen Studien wurden Maßnahmen zur Abschwächung dieser Auswirkungen untersucht und vorgeschlagen [13], [14]. Für die Homöopathie ist das Schütteln zusammen mit der Verdünnung jedoch ein wesentliches Instrument für die Arzneimittelzubereitung.
Ein Hauptproblem bei potenzierten Lösungen in hohen Verdünnungen (30C, 200C usw.) jenseits der Avogadro-Zahl, die die Verdünnungsgrenze (12C) festlegt, jenseits derer die ursprüngliche Substanz nicht mehr vorhanden sein kann, besteht darin, dass der Ausgangsstoff nicht einmal in der geringsten Menge zu erwarten ist [15]. Dennoch haben Chikramane et al. [10] in einer Studie über aus Metallen gewonnene Arzneimittel das Vorhandensein der Ausgangsstoffe in Form von Nanopartikeln in extremen Verdünnungen von 30C und 200C durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Elektronenbeugung und induktiv gekoppelte Plasma-Atomemissionsspektroskopie (ICP-AES) nachgewiesen. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Techniken zur Charakterisierung homöopathisch hergestellter Heilmittel eingesetzt, die das Vorhandensein spezifischer Strukturen selbst in stark verdünnten Arzneimitteln aufzeigen [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24]. In der wissenschaftlichen Gemeinschaft ist jedoch bekannt, dass das Benveniste-Experiment [25] kurz nach der Veröffentlichung seiner Ergebnisse von einer wissenschaftlichen Kommission, die von der Zeitschrift Nature in das Labor des Autors geschickt wurde, als falsch erwiesen wurde, wie George Vithoulkas in seinem Artikel „The controversy over the memory of the water“ [26] erläutert.
Wasser ist ein besonderes Lösungsmittel, das bei biologischen und chemischen Prozessen eine wichtige Rolle spielt [27]. Daher ist das Verständnis der anomalen Eigenschaften von flüssigem Wasser von ständigem Interesse, und es wurden viele experimentelle und theoretische Studien durchgeführt, um seine Struktur zu verstehen [28], [29]. Dennoch werden die Struktur und die Dynamik von Wasser immer noch diskutiert [30]. Die Empfindlichkeit der OH-Streckungsmode gegenüber verschiedenen lokalen Umgebungen ermöglicht den Einsatz der Schwingungsspektroskopie bei der Untersuchung der Struktur und Dynamik von flüssigem Wasser [28]. Die Untersuchung von flüssigem Wasser mittels Infrarot- und Raman-Spektroskopie zeigt breite Spitzen in der OH-Streckungsregion, was auf mehrere zugrunde liegende Beiträge (von verschiedenen Spezies, die durch unterschiedliche lokale Wasserstoffbrückenbindungen hervorgerufen werden) hindeutet, während in den Spektren von Eis deutliche Spitzen zu erkennen sind [31]. Im Jahr 2009 analysierte Sun [32] flüssiges Wasser unter Umgebungsbedingungen mittels Raman-Spektroskopie und schlug die Entfaltung des OH-Streckbereichs in fünf Unterbänder vor. Aufgrund der Komplexität von Wasser und der hohen Verdünnung der untersuchten Lösungen ist eine solche Analyse jedoch eine sehr schwierige Aufgabe. Um diesen Schwierigkeiten zu begegnen, wurden chemometrische Techniken und in jüngerer Zeit Modelle des maschinellen Lernens (ML) zur Analyse und zum Lernen von Daten auf Raman-Signale angewendet [33].
ML-Algorithmen erfreuen sich derzeit zunehmender Beliebtheit bei Klassifizierungsanwendungen [34], [35]. In jüngster Zeit wurden traditionelle und Deep-Learning-Algorithmen erfolgreich eingesetzt, um die Raman-Spektren verschiedener komplexer Materialien (z. B. Mineralien) zu unterscheiden oder hochdimensionale spektroskopische Daten zu klassifizieren [36], [37], [38].
Deep Learning (DL) ist ein Teilbereich von ML, der wesentlich robuster ist als die in der Vergangenheit verwendeten, auf Merkmalen basierenden Methoden. DL-Ansätze haben viele Vorteile, u. a. sind sie zeitsparend, erfordern keine Merkmalskonstruktion und führen zu besseren Ergebnissen. Künstliche neuronale Netze, oft als ANNs bezeichnet, sind die Vorläufer der DL-Techniken. ANNs bestehen aus einer Eingabeschicht, einer oder mehreren mittleren Ebenen (Schichten) und einer Ausgabeschicht. Diese Ansätze werden häufig durch überwachtes Lernen trainiert, was bedeutet, dass im Trainingsprozess vordefinierte Bezeichnungen für einen Datensatz verwendet werden. Das Convolutional Neural Network (CNN) [39], eines der repräsentativsten DL-Netze, ist eine Art neuronales Netz mit Vorwärtsrückkopplung, das Faltungsoperationen und eine sehr große Anzahl von Filtern verwendet. Es gibt viele verschiedene Arten von faltungsbasierten Lernalgorithmen, die je nach der gewünschten Aufgabe eingesetzt werden können. Typischerweise werden 2-D CNN-Modelle für bildgesteuerte Anwendungen verwendet. Die gated recurrent unit (GRU) [40], [41] und 1-D CNN-Modelle werden für zeitreihenbasierte Vorhersage- oder Klassifizierungsaufgaben verwendet. Die Hauptmotivation ist, dass rekurrente Modelle die Fähigkeit haben, langfristige Beziehungen zwischen Sequenzdaten zu erhalten. Diese Ansätze bieten eine wesentliche Unterstützung bei der Lösung des Problems des verschwindenden Gradienten [42].
In der vorliegenden Arbeit wird die strukturelle Organisation von potenzierten ethanol- und wasserbasierten Lösungen von Gold, einem homöopathischen Heilmittel namens Aurum metallicum (AUR), untersucht. Drei stark verdünnte (6C, 30C und 200C) AUR-Lösungen wurden von zwei unabhängigen Labors in Rumänien und der Türkei einer TEM-Analyse unterzogen. Beide Laboratorien bestätigten unterschiedliche Organisationen dieser Lösungen. Die Wahl dieser zentesimalen Verdünnungen war durch die Notwendigkeit motiviert, Lösungen zu untersuchen, die geringe Mengen der Ausgangssubstanz enthielten, sogar über die Avogadro-Zahl hinaus (d. h. die letzten beiden untersuchten Verdünnungen). Raman-Spektren wurden auch für verschiedene potenzierte Lösungen auf Wasserbasis (gereinigtes Wasser (PW), ungereinigtes Wasser (UW) und Goldlösung auf PW-Basis (AUR)) erhalten und mit DL-Algorithmen verarbeitet, um die Fähigkeit der GRU-Modelle zu untersuchen, zwischen all diesen Lösungen zu unterscheiden und die Proben innerhalb der untersuchten Kategorien (AUR, PW und UW) oder innerhalb der drei Potenzierungsstufen (6C, 30C und 200C) zu klassifizieren. DL wurde verwendet, um seine Effizienz bei der Klassifizierung von Raman-Spektren zu bewerten. Bei den Raman-Spektralwerten wird davon ausgegangen, dass es sich um Zeitreihenwerte handelt; daher haben wir ein rekurrentes neuronales Netz verwendet. Wir haben Experimente mit dem GRU-Modell durchgeführt, da es sowohl das Problem des verschwindenden Gradienten als auch das der Geschwindigkeit löst. Auf diese Weise haben wir getestet, ob dieser Klassifizierungsansatz in Kombination mit der Raman-Spektroskopie für die Analyse von wässrigen Lösungen, die nach der Potenzierung erhalten wurden, verwendet werden kann. Anhand unserer Ergebnisse konnten wir nachweisen, dass dieses Methodenpaket (TEM-EDX und Raman-Spektroskopie in Kombination mit DL) erfolgreich zur Charakterisierung und Differenzierung stark verdünnter Lösungen nach der Potenzierung eingesetzt werden kann.

2. Material und Methoden

2.1. Materialien

Alle untersuchten Lösungen wurden von der Firma Korres (Athen, Griechenland) hergestellt, einem von der Nationalen Arzneimittelbehörde (EOF – Griechenland) zertifizierten Unternehmen. Diese Lösungen wurden in Übereinstimmung mit dem Deutschen Homöopathischen Arzneibuch (GHP) unter Einhaltung der Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) [43] und unter Berücksichtigung der Konformitätsprüfungsverfahren des Europäischen Arzneibuchs hergestellt, wobei einige wenige Ausnahmen klar angegeben sind. Die Ausnahmen betreffen insbesondere die im letzten Schritt des Zubereitungsprozesses verwendeten Lösungsmittel: 50 % v/v Ethanol für Lösungen auf Ethanolbasis und gereinigtes Wasser für Lösungen auf Wasserbasis. Die Lösungen wurden auf der Grundlage des Ausgangsmaterials in drei Gruppen eingeteilt: gereinigtes Wasser (PW), ungereinigtes Wasser (UW) und Aurum metallicum (AUR). Für jede Kategorie wurden drei Potenzstufen (6C, 30C und 200C) hergestellt, wobei drei Chargen jeder Potenzstufe an verschiedenen Tagen produziert wurden. Die C-Schreibweise steht für Zentesimalverdünnung und bedeutet 1 Teil der konzentrierten Lösung/vorher potenzierten Lösung auf 99 Teile Eluent (Masse/Mass).
Für die PW- und UW-Proben sollten potenzierte Lösungen hergestellt werden, die in jeder Hinsicht den Arzneimittellösungen entsprechen, mit Ausnahme des Fehlens eines Wirkstoffs. PW (Konformität nach dem Europäischen Arzneibuch – Ph. Eur.) wird im Allgemeinen für die Herstellung homöopathischer Mittel verwendet, während UW teilweise gereinigt ist. Die in dieser Studie verwendeten Wassertypen wiesen nach Angaben der Firma Korres folgende Eigenschaften auf: PW – Leitfähigkeit 0,7-0,88 µS/cm, pH-Wert 6,4-6,8, NO3- <0,2 ppm, und Metallionen, Al < 3-5 ppb, As < 0,005 ppm, Pb 0,00032 ppm, Cd < 0,001 ppm, Hg < 0,0005 ppm (Schwermetalle insgesamt 0.00682 ppm, Grenzwert < 0,1 ppm); UW – Leitfähigkeit 196 µS/cm, pH 7,8, HCO3- 66 ppm, Cl- 22 ppm, NO3- 9,8 ppm, Na+ 15 ppm, Ca2+ 10 ppm, Mg2+ 8,8 ppm, CO2 9,7 ppm. Als Ausgangsmaterial wurde gereinigtes Wasser nach Ph. Eur. bzw. ungereinigtes Wasser verwendet. Das Ph. Eur. gereinigte Wasser wurde auch für den Verdünnungsprozess und, aufgrund der spezifischen experimentellen Zwecke, für die Herstellung der 30C- und 200C-PW- und UW-Lösungen verwendet.

Für die AUR-Kategorie wurde zunächst eine Methode auf der Grundlage der Trituration von Aurum metallicum mit Laktosemonohydrat als Vehikel bis zum 4C-Niveau angewandt; dann wurde für die Herstellung der 6C-Flüssigpotenz gereinigtes Wasser (Konformität nach Ph. Eur.) für die Herstellung der 5C-Potenz und Ethanol 30 % (m/m) für die Herstellung der 6C-Flüssigpotenz verwendet. Ab 6C und bis 29C, und dementsprechend bis C199, wurde das gereinigte Wasser nach Ph. Eur. für den Herstellungsprozess verwendet. Die endgültigen potenzierten Lösungen von 30C und 200C wurden mit Ethanol 50 % (v/v) für AUR-Lösungen auf Ethanolbasis hergestellt. Aufgrund der spezifischen Versuchszwecke wurde für die Herstellung der 30C- und 200C-AUR-Lösungen auf Wasserbasis gereinigtes Ph.Eur.-Wasser verwendet.

2.1.1. Transmissions-Elektronenmikroskopie

Für die TEM-Untersuchungen wurden zwei Arten von AUR-Proben verwendet; die erste Art von AUR, die in einer 50 %igen Ethanollösung hergestellt wurde, wurde in Rumänien analysiert und als E-AUR bezeichnet, während die zweite Art von AUR nur in gereinigtem Wasser (PW) hergestellt und in der Türkei analysiert wurde (als W-AUR bezeichnet). Für beide Arten von AUR wurden drei potenzierte Proben untersucht, nämlich 6C, 30C und 200C.

2.1.2. Raman-Untersuchungen

Für die Raman-Untersuchungen wurden drei Arten von Lösungen verwendet: gereinigtes Wasser (PW), ungereinigtes Wasser (UW) und AUR. Zusätzlich wurden für die Gruppen PW und UW nicht potenzierte Proben (Referenzproben der für den Potenzierungsprozess verwendeten Wasserarten) und drei Arten von potenzierten Wasserproben (6C, 30C und 200C) berücksichtigt; für jede Art von potenzierten Wasserproben wurden drei Chargen an drei verschiedenen Tagen hergestellt. Für die Kategorie AUR wurden nur die potenzierten Lösungen auf Wasserbasis untersucht. Das heißt, es wurden insgesamt 12 Proben für PW, 12 Proben für UW und 9 Proben für AUR berücksichtigt.

2.2. Methoden

2.2.1. Rumänische TEM- und EDX-Verfahren

Die strukturelle und morphologische Charakterisierung der AUR-Proben wurde mit einem Hitachi HD-2700-Rastertransmissionselektronenmikroskop (STEM) durchgeführt, das mit einem Sekundärelektronendetektor (SE), einem Transmissions-Elektronendetektor (TE) (Hitachi High Tech, Japan) und einer Kaltfeld-Emissionskanone für hochauflösende (HRTEM) Bilder mit einer Auflösung von 0,144 nm ausgestattet war. Kohlenstoffbeschichtete TEM-Gitter wurden mit 6 µl der potenzierten AUR-Lösungen behandelt, die zuvor zur Homogenisierung 10-mal gesaugt wurden. Nach 1-2 Minuten wurde die überschüssige Flüssigkeit mit Whatman-Filterpapier der Klasse 1 abgetupft, und die Gitter wurden an der Luft getrocknet. Die Proben wurden mit einem bei 200 kV betriebenen STEM-System analysiert. Für die EDX-Untersuchungen wurde ein duales EDX-System bestehend aus einem X-Max N100TLE Silizium-Drift-Detektor (SDD) (Oxford Instruments) verwendet.

2.2.2. Türkische TEM- und EDX-Verfahren

TEM-Bilder der drei Potenzen (6C, 30C und 200C) von AUR wurden mit einem Hitachi HT 7800 TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV aufgenommen. Nachdem jede Probe 10 Mal geschüttelt wurde, wurde 1 Tropfen auf ein mit Kohlenstoff beschichtetes Gitter getropft und in einer sauberen Umgebung getrocknet. Die EDX-Analyse der Proben wurde mit einem Oxford Instruments X-MaxN durchgeführt, das an das gleiche TEM-Gerät angeschlossen war, um das Vorhandensein von Gold zu bestätigen.

Die für die rumänischen und türkischen TEM-Bilder erstellten Histogramme wurden auf der Grundlage von Daten erstellt, die mit der Software ImageJ (NIH, USA) gewonnen wurden.

2.2.3. Raman-Spektroskopie

Raman-Spektren wurden mit einem NRS-3300 Raman-Spektrometer (Jasco, Japan) aufgenommen, das mit einem CCD-Detektor (charge-coupled device) ausgestattet ist und mit einem 514,5 nm-Laser (grünes Licht) angeregt wurde. Die Lösungen wurden in Glaskapillarröhrchen (Marienfeld, Deutschland) mit einem Durchmesser von 1,5-1,6 mm analysiert. Ein Olympus UMPLFL 20X Objektiv, ein 600 l/mm Gitter, ein 0,1 × 6 mm Spalt, eine Belichtungszeit von 120 s und drei Scans wurden verwendet, um die Raman-Spektren von etwa 72 cm-1 bis 4020 cm-1 aufzunehmen. Der 521 cm-1-Peak, der dem Si entspricht, wurde zur Kalibrierung des Spektrometers verwendet. Rohe und verrauschte Daten wurden nicht entrauscht oder geglättet, und Ausreißer wurden nicht aus dem Datensatz entfernt. Die Vorverarbeitung der Daten umfasste zwei Hauptschritte und wurde mit Spectra Manager (JASCO) und OriginPro 2023 (OriginLab Corporation) durchgeführt. Im ersten Schritt der Datenvorverarbeitung wurde ein Wellenzahlintervall von 180 bis 4000 cm-1 ausgewählt und die Anzahl der Merkmale auf unter 13.000 begrenzt, indem eine Spline-Methode dritter Ordnung mit einem Datenabstand von 0,3 angewendet wurde. Diese Daten wurden weiter auf [0,1] normalisiert und für die DL-Untersuchung als unbehandelte Raman-Daten betrachtet. Der zweite Schritt beinhaltete einen Grundliniensubtraktionsprozess (bg), der in OriginPro auf die Daten angewendet wurde, die vor der Normalisierung im ersten Schritt erhalten wurden. Um den bg-Prozess anzuwenden, wurden die folgenden Schritte durchgeführt: benutzerdefinierter Basislinienmodus, die Methode der zweiten Ableitung (Nullen) für die Ankerpunktdetektion, Fang am Spektrum, die Linieninterpolationsmethode und die gleiche Anzahl von Basislinienpunkten wie die Eingabedaten [44]. Die so erhaltenen Daten wurden weiter auf [0,1] normalisiert, bevor sie für die Erstellung der bg-vorbehandelten Datensätze für die DL-Studie verwendet wurden.

2.2.4. Tiefes Lernen

Die DL-Untersuchungen wurden mit der Programmiersprache Python und Colab Pro durchgeführt, das eine beschleunigte Rechenumgebung bietet. Das GRU-Modell wurde mit der Bibliothek Keras 2.12.0 erstellt und trainiert. Der Colab Tesla T4 Grafikprozessor wurde für das Training des Modells mit einer großen Stapelgröße verwendet. Der Tesla T4 verfügt über insgesamt 2560 CUDA-Kerne sowie über eine Rechenleistung von 3,7, 15 GB Speicher und GDDR6 VRAM. Außerdem wurde das Paket Sklearn 1.2.2 verwendet, um die gewonnenen Erkenntnisse zu analysieren und zu erklären. Weitere Einzelheiten zum Protokoll der DL-Untersuchungen sind in der Datei Supplementary Material und in den Abbildungen S1 und S2 zu finden.

3. Ergebnisse

Um festzustellen, ob die von uns vorgeschlagene Methode zur Charakterisierung verschiedener Lösungen und Potenzen geeignet ist, haben wir zunächst versucht, die Eigenschaften der Proben durch TEM-Analyse zu bestimmen.

3.1. TEM-Untersuchung

Die TEM ist ein wertvolles Instrument, das grundlegende Daten über die Organisation von Nanomaterialien liefert; dieses Wissen ist sehr wichtig für das Verständnis und die Entwicklung in der Materialwissenschaft sowie für Bereiche, die stark verdünnte Lösungen verwenden, die ebenfalls aus Nanostrukturen bestehen.

3.1.1. Aurum metallicum 6C

Abb. 1 zeigt mehrere TEM-Bilder, die mit zwei verschiedenen Geräten (siehe Abschnitt Methoden) für die 6C-Potenz von AUR aufgenommen wurden. Für die Probenvorbereitung wurden zwei verschiedene Medien verwendet – das erste Medium war eine 50 % v/v Ethanollösung, die für die in Rumänien analysierten AUR-Proben (E-AUR 6C) verwendet wurde. Das zweite Medium war gereinigtes Wasser, das für die in der Türkei untersuchten Proben verwendet wurde (W-AUR 6C).

Abb. 1. TEM-Daten für die 6C-Potenz von AUR. (A-C) TEM-Bilder und Histogramm der relativen Häufigkeit der Nanopartikelgrößen für die AUR-Proben auf Ethanolbasis und (D-G) für die Proben auf Wasserbasis; Einschub – EDX-Daten für die markierten Punkte oder das Summenspektrum.

Trotz der zugrundeliegenden Unterschiede bei den Lösungsmitteln sind die erhaltenen TEM-Bilder hinsichtlich der Form der Nanopartikel recht ähnlich. Die Größe der Nanopartikel hängt jedoch von der Art des Lösungsmittels ab. Die Histogramme der beiden Proben zeigen, dass die Nanopartikel bei E-AUR 6C kleiner sind als bei W-AUR 6C (Abb. 1C und G), was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass Ethanol als Stabilisierungsmittel wirksamer ist als Wasser. Die EDX-Daten (Einschübe in Abb. 1 und Abb. S3 und S4) zeigen vergleichbare Anteile an Gold (Au) in beiden Proben und das Vorhandensein von Silizium (Si) und Sauerstoff (O) (das Kupfer (Cu) stammt aus dem Gitter).

3.1.2. Aurum metallicum 30C

Außerdem wurde die 30C-Potenz von AUR untersucht; Abb. 2 und Abb. S5-S8 zeigen die TEM-Bilder, EDX-Daten und TEM-EDX-Mapping-Ergebnisse für diese Potenz. Hier sind die Ähnlichkeiten zwischen den beiden Proben, E-AUR 30C und W-AUR 30C, hinsichtlich der Form der Nanostruktur und des

Auftretens von Verunreinigungen erwähnenswert.

Abb. 2. TEM-Daten für die 30C-Potenz von AUR. (A-C) TEM-Bilder und Histogramm der relativen Häufigkeit der Nanopartikelgrößen für die AUR-Proben auf Ethanolbasis und (D-G) für die Proben auf Wasserbasis; Einschub – EDX-Daten für die markierten Punkte oder das Summenspektrum.

Wie im vorherigen Fall, der Potenz 6C, ist die Größe der Nanopartikel/Nanostrukturen der Potenz 30C bei E-AUR tendenziell kleiner als bei W-AUR (Abb. 2C und G); dieses Verhalten lässt sich durch die Fähigkeit von Ethanol erklären, als effizientes Stabilisierungsmittel zu wirken. Darüber hinaus zeigen die Histogramme in Abb. 1 und Abb. 2, dass die Nanostrukturen in E-AUR 30C kleiner sind als in E-AUR 6C und im Vergleich zu den wässrigen Proben um mehr als 150 nm abnehmen; diese großen Strukturen sind in W-AUR 6C deutlich zu erkennen, während sie in der W-AUR 30C-Probe nur in Spuren sichtbar sind. Diese signifikante Veränderung zwischen den Profilen der beiden Potenzen 6C und 30C tritt nach dem Potenzierungsprozess auf, der mehrere aufeinanderfolgende Verdünnungen und Sukzessionen umfasst.

3.1.3. Aurum metallicum 200C

Die Merkmale der 200C-Potenz sind in Abb. 3 und Abb. S9-S11 dargestellt und wurden durch die Analyse von zwei Proben (E-AUR 200C – hergestellt mit einer wässrigen 50 % v/v Ethanollösung und W-AUR 200C

• nur mit gereinigtem Wasser hergestellt) ermittelt.

Abb. 3. TEM-Daten für die 200C-Potenz von AUR. (A-C) TEM-Bilder und Histogramm der relativen Häufigkeit der Nanopartikelgrößen für die Proben auf Ethanolbasis und (D-G) für die Proben auf Wasserbasis; Einschub – EDX-Daten für die markierten Punkte oder das Summenspektrum.

Die allgemeine Tendenz, die für die Potenzen 6C und 30C beobachtet wurde, ist auch hier vorhanden; genauer gesagt ist die Größe der Nanostrukturen in der Probe E-AUR 200C kleiner als in W-AUR 200C, wie aus den Histogrammen in Abb. 3 hervorgeht. Darüber hinaus sind die Nanopartikel in beiden 200C-Proben größer als die in der 30C-Potenz beobachteten Nanopartikel und unterscheiden sich in Größe und Form stark von den Nanopartikeln in der 6C-Potenz (Abb. 1, Abb. 2, Abb. 3).

Abb. 3B zeigt eine ausgeprägte Organisation und das völlige Fehlen von Verunreinigungen innerhalb einiger AUR 200C-Cluster-Assemblies. Darüber hinaus zeigen beide AUR 200C-Proben eine bevorzugte verzweigte Anordnung (Abb. 3A und D), und das Vorhandensein kleiner Mengen von Verunreinigungen wie Si und Fe in diesen Clustern wird durch die EDX-Daten in der Beilage zu Abb. 3 und in den Abbildungen S9 und S11B nachgewiesen.

3.2. Raman-Spektroskopie und Deep-Learning-Untersuchungen

Nach der Durchführung der TEM-Studien kann eine schnelle und zerstörungsfreie Technik wie die Raman-Spektroskopie für die Analyse der untersuchten Lösungen in Betracht gezogen werden. Da bei den wässrigen Proben im TEM größere Anordnungen beobachtet wurden und die Raman-Eigenheiten von Wasser-Ethanol-Lösungen berücksichtigt wurden, wurde die Raman-Spektroskopie nur auf die wässrigen Lösungen angewandt. Ziel war es, die Umwandlungen zu untersuchen, die in drei Gruppen/Kategorien auftreten: PW, UW und AUR. PW wird im Allgemeinen für die Zubereitung homöopathischer Mittel verwendet, während UW eine teilweise gereinigte Form von Wasser ist; diese Wassertypen weisen unterschiedliche Eigenschaften auf. Die PW-Proben weisen eine niedrige Leitfähigkeit (0,7-0,88 µS/cm) und einen geringen Ionengehalt auf (NO3- <0,2 ppm, Al < 3-5 ppb, Schwermetalle insgesamt 0,00682 ppm), während die UW-Proben eine höhere Leitfähigkeit (196 µS/cm) und höhere Konzentrationen an verschiedenen Ionen (Nitrat, Bikarbonat, Natrium usw.) aufweisen. Weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt Material und Methoden.

Die Potenzierung wurde auf PW-, UW- und AUR-Proben angewandt, die an drei verschiedenen Tagen hergestellt wurden, um drei Chargen potenzierter Proben in den Potenzen 6C, 30C und 200C zu erhalten. PW und UW werden im Allgemeinen nicht für die Vermarktung potenziert; das Potenzierungsverfahren wurde nur für diese Studie angewandt. So wurden 33 Proben mittels Raman-Spektroskopie analysiert. Jede Probe wurde an 5 Punkten analysiert, um repräsentative Daten für die untersuchten Lösungen zu erhalten. Insgesamt wurden 165 Raman-Spektren (Bereich 180-4000 cm-1) der Klassifizierungsstudie unterzogen. Die rohen und mit bg vorbehandelten Raman-Spektren, die während dieses Experiments für verschiedene Potenzierungsstufen (6C, 30C und 200C) der untersuchten Probentypen (PW, UW und AUR) erhalten wurden, sind in den Abbildungen S12-S17 dargestellt.

3.2.1. Klassifizierung aller Klassen mit Deep Learning unter Verwendung des GRU-Modells

Die Ergebnisse der Raman-Spektralklassifizierung für die 11 verschiedenen Klassen, die mit dem trainierten GRU-Modell erzielt wurden, sind in Abb. 4 dargestellt; es wurden sowohl unbehandelte als auch bg-vorbehandelte Datensätze berücksichtigt.

Abb. 4. Konfusionsmatrix des GRU-Modells für (A) unvorbehandelte und (B) bg-vorbehandelte Daten aller untersuchten Kategorien

Die Konfusionsmatrix wird angezeigt, um einen Überblick über die Anzahl der Fälle zu geben, in denen das GRU-Modell das Ergebnis richtig oder falsch vorhergesagt hat. Das Modell beweist eine sehr gute Erkennungsleistung beim Vergleich der drei untersuchten Kategorien; so zeigt es eine große Effizienz bei der Unterscheidung zwischen den Kategorien AUR, PW und UW, wenn unbehandelte Raman-Daten betrachtet werden (Abb. 4A). In diesem Fall kann eine Genauigkeit von 88 % (Tabelle 1) festgestellt werden; dieser Wert kann als sehr gut angesehen werden, insbesondere wenn die großen Ähnlichkeiten zwischen den untersuchten Klassen berücksichtigt werden. Dieser Wert, der etwas unter 90 % liegt, ist größtenteils das Ergebnis falscher Zuordnungen, die für unterschiedliche Potenzierungsstufen oder Referenzproben derselben Kategorie generiert wurden; nur drei falsche Zuordnungen wurden zwischen den drei untersuchten Klassen – AUR, PW, UW – registriert (eine Probe von AUR200C wurde UW200C zugeordnet und zwei Proben von UW30C wurden AUR6C bzw. AUR200C zugeordnet).

Tabelle 1. Klassifizierungsergebnisse, die mit unbehandelten und baseline-subtrahierten (bg-vorbehandelten) Raman-Daten erzielt wurden.

Bei der Kategorie AUR waren die anderen drei falschen Zuordnungen also auf die Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen Potenzierungsgraden innerhalb der Gruppe zurückzuführen. Ein ähnliches Verhalten wurde auch bei den Gruppen PW und UW beobachtet. Es gab keine Fehler im Zusammenhang mit der Unterscheidung von PW- und AUR- oder UW-Proben. Innerhalb der PW- und UW-Gruppen wurde eine korrekte Erkennung für die Potenzstufe 200C beobachtet, während für die anderen Potenzierungsstufen bis zu 5 Proben falsch zugeordnet wurden (dieses Maximum wurde in der PW6C-Klasse erreicht).

Bei der Anwendung des GRU-Modells auf den mit bg vorbehandelten Datensatz ergab sich jedoch eine Genauigkeit von nur 59 % (Abb. 4B und Tabelle 1). Die meisten falschen Klassifizierungsergebnisse wurden innerhalb der drei untersuchten Gruppen erzielt, aber es gab auch einige falsche Zuordnungen zu Proben außerhalb der richtigen Gruppe. Diese Ergebnisse zeigen, dass die schlechte Erkennungsleistung des Modells auf den Informationsverlust zurückzuführen ist, der bei der Anwendung der Hintergrundsubtraktion auf die Ramandaten auftrat. Die Gruppen AUR und UW scheinen am stärksten betroffen zu sein (Abb. 4B).

Tabelle 1 enthält eine eingehende Analyse der Leistungswerte des vorgeschlagenen Ansatzes. Die Werte für Präzision, Recall und f1 wurden für jede Klasse unabhängig voneinander ermittelt. Die Ergebnisse de

Experimente zeigen, dass die Makro-f1-Werte für die beiden Datensätze 0,88 und 0,59 betragen. Bemerkenswert ist, dass die Kategorien PW, PW6C, PW30C und PW200C in beiden Datensätzen stabile Erkennungsraten aufweisen. Wenn die Wiedererkennungswerte berücksichtigt werden, neigt das Modell dazu, die Klassifizierungsgenauigkeit von UW30C-Proben zu unterschätzen. Aus den Ergebnissen lässt sich ableiten, dass die Unterscheidungskraft dieses Modells für die UW-Daten insgesamt etwas begrenzt ist. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit die Verwendung eines bekannten Ansatzes des maschinellen Lernens, insbesondere der Support-Vektor-Maschinen (SVM), für die Kategorisierung von Raman-Daten untersucht. Verglichen mit der Deep-Learning-Methode (GRU) lieferte die traditionelle maschinelle Lerntechnik (SVM) die niedrigsten Genauigkeitswerte für die beiden Datensätze.

In Anbetracht dieser Ergebnisse wurde eine eingehendere Untersuchung durchgeführt, und zwar wurde ein intelligenter Ansatz zur Datenerweiterung verwendet, um den Datensatz zu vergrößern. So wurde jedes Raman-Spektrum mit Hilfe einer spektralen Segmentierungsstrategie in kleinere Segmente unterteilt. Die Größe der Segmente wurde auf 1 × 1024 festgelegt. Wenn die Stichprobengröße beispielsweise auf 1 × 12733 festgelegt wird, werden insgesamt etwa 12 einzigartige Segmente erfasst. Der Originaldatensatz enthält 15 Instanzen für eine bestimmte Klasse. Nach Abschluss des Segmentierungsverfahrens wird der Datensatz auf 1980 × 1024 verkleinert und besteht aus 11 verschiedenen Klassen. Die Anzahl der Stichproben pro Klasse beträgt somit 180. Der Datensatz wird dann aufgeteilt, wobei 80 % für das Training und der restliche Teil für Testzwecke reserviert wird. Die fünffache Kreuzvalidierung wurde angewendet, um die Leistung unseres GRU-Modells auf den erhaltenen Segmentierungsdatensätzen zu messen. Bei diesem Ansatz wurde festgestellt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Erhöhung der Segmentgröße und der Abnahme der Leistung besteht. Die in Abb. S18 und Tabelle S1 dargestellten experimentellen Ergebnisse, die durch Einbeziehung der Stichproben aus den Testdatensätzen erzielt wurden, zeigen, dass unser GRU-Modell eine hohe Genauigkeit von 99,45 % für unbehandelte Daten und eine perfekte Genauigkeit von 100 % für bg-vorbehandelte Daten über 11 Klassen hinweg erreicht. Auch wenn weitere Untersuchungen, z. B. mit einer größeren Anzahl von Stichproben, durchgeführt werden müssen, bevor die spektrale Segmentierungsstrategie als die am besten geeignete für Experimente mit einer großen Anzahl von Klassen vorgeschlagen werden kann, kann diese Strategie als wertvoller Ansatz zur Datenerweiterung für unsere Art von Daten betrachtet werden.

3.2.2. Klassifizierung der Potenzen innerhalb jeder Gruppe mit Deep Learning unter Verwendung des GRU-Modells

Die mit der DL-Methode erzielte Erkennungsrate innerhalb jeder Kategorie (AUR 6C, AUR 30C, AUR 200C, PW), (PW, PW 6C, PW 30C, PW 200C) und (UW, UW 6C, UW 30C, UW 200C) wurde anhand von unbehandelten und bg-vorbehandelten Raman-Daten analysiert und die Ergebnisse hinsichtlich der Leistungswerte verglichen. Abb. 5 veranschaulicht die Ergebnisse der Experimente nach Anwendung der geschichteten 15-fachen Kreuzvalidierung (CV).

Abb. 5. Leistung des Deep-Learning-Modells zur Bewertung der Unterscheidung innerhalb jeder Gruppe unter Verwendung von (A-B-C) unbehandelten und (D-E-F) bg-vorbehandelten Daten.

Um die Proben für Validierungs- und Trainingszwecke zuzuordnen, haben wir eine 15-fache Aufteilung vorgenommen, wobei 11 Proben für die Validierung und die restlichen Proben für das Training ausgewählt wurden. Für die AUR-Gruppe wurde die nicht potenzierte PW-Klasse als Referenz verwendet.

Im Fall von AUR und PW zeigen die erstellten Konfusionsmatrizen, dass 98 % und 78 % Genauigkeit erzielt wurden (Abb. 5A und D). Die Ergebnisse zeigten Genauigkeiten von 90 und 75 % für die PW-Gruppe (Abb. 5B und E), während für die UW-Gruppe Genauigkeiten von 92 und 68 % erzielt wurden (Abb. 5C und F). Im Allgemeinen weisen die Gruppen PW6C und UW30C im Vergleich zu den anderen Klassen eine geringe Leistung auf. Nach einer allgemeinen Analyse wird deutlich, dass die AUR-Gruppe die wenigsten falschen Klassifizierungen aufweist und dass die meisten Fehlklassifizierungen aufgrund der großen Ähnlichkeit zwischen den Klassen 6C und 30C auftreten.

3.2.3. Klassifizierung innerhalb der gleichen Potenzierungsstufe mit Deep Learning unter Verwendung des GRU-Modells

Zusätzlich wurde die Leistung von DL bei der Unterscheidung von Klassen innerhalb der gleichen Potenzierungsstufe auf der Grundlage ihrer Raman-Spektren analysiert (Abb. 6). Bei der Kategorisierung der Potenzierungsstufen wurden fünf Klassen berücksichtigt, darunter die potenzierten AUR-, PW- und UW-Proben sowie die nicht potenzierten PW- und UW-Proben als Referenz. Die Analyse der Ergebnisse zeigte, dass das GRU-Modell für die 6C-Potenz Genauigkeitswerte von 99 % (unbehandelt) und 84 % (bg-vorbehandelt) lieferte. Für die 30C-Potenz wurden ebenfalls Genauigkeitswerte von 95 % (unbehandelt) und 83 % (bg-vorbehandelt) ermittelt. Für die 200C-Potenz erbrachte das GRU-Modell Genauigkeitswerte von 96 % (unbehandelt) und 77 % (bg-behandelt). Die beste Leistung des GRU-Modells wurde also bei niedrig verdünnten Lösungen (6C) beobachtet.

Abb. 6. Leistung des Deep-Learning-Modells für die Bewertung der Unterscheidung innerhalb jeder Potenzierungsstufe unter Verwendung von (A-B-C) unbehandelten und (D-E-F) mit bg vorbehandelten Daten.

4. Diskussion

Die Notwendigkeit, zuverlässige Techniken zur effizienten Charakterisierung ultrahochverdünnter Lösungen zu finden, ist bekannt. In dieser Studie zeigen wir, dass es möglich ist, eine Reihe von Methoden (TEM-EDX und Raman-Spektroskopie in Kombination mit DL) zur erfolgreichen Charakterisierung und Differenzierung von hochverdünnten Lösungen, die nach der Potenzierungsbehandlung erhalten werden, einzusetzen. TEM-EDX kann zur Beurteilung der Zusammensetzung und Morphologie jeder kolloidalen Lösung verwendet werden. Wir zeigen hier, dass diese Technik selbst bei stark verdünnten Lösungen effizient ist und es uns ermöglicht, wertvolle Informationen zu jedem Potenzierungsgrad zu erhalten und sie auf diese Weise zu unterscheiden, indem wir ein Bild erstellen, das mit jedem Potenzierungsgrad in Verbindung gebracht werden kann.

Generell lässt sich feststellen, dass die Morphologie der AUR 6C-Lösung derjenigen üblicher kolloidaler Goldnanopartikellösungen ähnelt [45]; die Größe der Goldnanopartikel hängt von der Art der im Syntheseprozess verwendeten Rohstoffe ab. Bei den beiden anderen Potenzen von AUR, 30C und 200C, scheint ihr Design durch das Konstruktionsgesetz bestimmt zu werden, das die strategische Entwicklung neuartiger Architekturen auf der Grundlage eines physikalischen Gesetzes vorhersagt [46].

Si und O sind die beiden Elemente, die in den AUR 30C-Proben allgegenwärtig sind, während in der E-AUR 30C-Probe, deren Bestandteile kleiner sind, isolierte Nanopartikel mit Verunreinigungen wie Eisen (Fe), Titan (Ti), Kalzium (Ca), Magnesium (Mg) und Aluminium (Al) sichtbar sind (Abb. 2 und Abb. S5-S7). Diese Verunreinigungen stammen entweder aus dem verwendeten Lösungsmittel oder könnten sich während der Potenzierungsbehandlung durch Herauslösen aus den Glasfläschchen bilden (z. B. Si oder Ti). Der Grund dafür, dass diese Verunreinigungen in der Potenz 30C so offensichtlich sind, kann auf die Größe der Bestandteile des Mittels zurückgeführt werden, die kleiner sind als die Bestandteile der anderen beiden Potenzen (6C und 200C), wie in den Histogrammen von Abb. 1C und G, 2C und G und 3C und G dargestellt. Darüber hinaus sind das in der Probe W-AUR 30C beobachtete fadenförmige Profil (Abb. 2D), das Auftreten einiger Strukturen auf Kohlenstoffbasis (C) in E-AUR 30C (Abb. S7B) und das Vorhandensein von Gold in den beiden Proben der Potenz 30C (Abb. 2 Einschub und Abb. S5 und S8B) hervorzuheben.

All diese Beobachtungen deuten auf eine unterschiedliche Organisation der 6C- und 30C-Potenzen von AUR hin und deuten auf das Vorhandensein sowohl von Nanopartikeln als auch von Clustern in den 30C-Proben hin. Die eindeutige Nanopartikelform der Verunreinigungen und die aus kleinen Strukturen gebildeten filiformen/clusterartigen Anordnungen legen den Gedanken nahe, dass zumindest bei AUR 30C die beobachtete Organisation nicht in erster Linie mit den nanopartikulären Systemen zusammenhängt, sondern eher mit großen Anordnungen (Clustern) kleiner Strukturen. Höchstwahrscheinlich enthalten diese Cluster auch Ethanol- und Wassermoleküle (in E-AUR) oder Wassermoleküle (in W-AUR), während Verunreinigungen, die entweder isoliert oder mit diesen großen Ansammlungen verbunden sind, als Nanopartikel erscheinen (klare runde Form und unterschiedliche Größen). Obwohl Gold in allen untersuchten Proben nachgewiesen wurde, erscheint es in den TEM-EDX-Mapping-Bildern auf der Gitteroberfläche verstreut.

Die für die AUR 200C-Proben erzielten Ergebnisse deuten auf eine ausgedehnte Organisation der AUR 200C-Moleküle hin, was auf das Vorhandensein stabiler und organisierter Strukturen über eine größere Fläche hinweist. Die Verunreinigungen liegen in großen Ansammlungen vor (Abb. S10B); so sind in den TEM-EDX-Mapping-Ergebnissen große, miteinander verbundene Verunreinigungen (im Mikrometerbereich) wie Si, Al, Fe und O zu erkennen. Das fadenförmige Profil kann auch für die W-AUR 200C-Proben (Abb. 3A, 3D) sowie das Auftreten einiger Kohlenstoff (C)-basierter Strukturen in E-AUR 200C (Abb. S10A und S10C) und das Vorhandensein von Gold in den beiden untersuchten 200C-Probentypen festgestellt werden (Abb. 3 Einschub und Abb. S9 und S11B).

Einige dieser Ergebnisse werden durch die Literatur gestützt; so wurde das Vorhandensein von Gold auch bei hohen Potenzen (30C und 200C) von AUR, die jenseits der Avogadro-Zahl liegen, in den Arbeiten von Chikramane et al. [10] und Rajendran [47] nachgewiesen. In der Arbeit von Chikramane et al. wurde die elementare Zusammensetzung der TEM-Partikel durch Elektronenbeugung (SAED) ermittelt und durch ICP-AES-Analyse bestätigt [10]. Die Studie von Rajendran unterstreicht die Idee, dass Nanopartikel in allen Lösungen hauptsächlich auf der Quantenpunktskala zu finden sind [47]; ihre Partikelgrößen sind unseren Daten ungefähr ähnlich. Diese nanopartikuläre Sichtweise wird auch durch unsere Ergebnisse gestützt, aber darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass die Struktur von AUR Nanopartikel und Clusteranordnungen kombiniert, die aus kleineren oder größeren Nanostrukturen bestehen. Diese Clusteranordnungen sind bei hohen Verdünnungen jenseits der Avogadro-Zahl deutlicher zu erkennen und werden von der Art des Lösungsmittels und dem Grad der Potenzierung beeinflusst; je höher die Potenz ist, desto verzweigter und größer sind die gebildeten Strukturen. Eine Ausdehnung dieser Organisation über eine große Fläche sollte zu stabileren Strukturen führen und könnte mit dem von Bejan und Lorente [46] beschriebenen Konstruktionsgesetz von Design und Evolution in der Natur übereinstimmen.

Zusätzlich zur TEM-EDX-Studie haben wir untersucht, ob eine auf Raman-Spektroskopie und DL basierende Methodik in der Lage ist, Lösungen zu klassifizieren, die sich in ihrer Struktur nicht signifikant unterscheiden, wie z. B. i) PW- versus UW-Lösungen, die subtile Unterschiede aufweisen, da das in diesen Experimenten verwendete UW im Wesentlichen ein teilweise gereinigtes Wasser ist, das in Kosmetika verwendet wird, und ii) PW- versus AUR-Lösungen, bei denen die Unterschiede auf das Vorhandensein von sehr geringen Goldkonzentrationen in den AUR-Proben zurückzuführen sind. Darüber hinaus führen die Komplexität und die Dynamik von Strukturen auf Wasserbasis zu einer Reaktion im untersuchten Raman-Bereich (insbesondere im OH-Streckbereich), wie von Sun [32] und mehreren anderen Autoren [28], [29], [30], [31] nachgewiesen wurde.

Die Ergebnisse für alle drei untersuchten Situationen (Klassifizierung aller Klassen, Klassifizierung von Potenzen innerhalb jeder Gruppe (AUR, PW und UW) oder Klassifizierung innerhalb derselben Potenzierungsstufe (6C, 30C und 200C) zeigen, dass DL-Ansätze verwendet werden können, um verschiedene Klassen einfach und effektiv zu erkennen. In dem Datensatz, bei dem die Grundlinie entfernt wurde (nämlich bg-pretretreated), ist das GRU-Modell nicht in der Lage, den Datentrend in seiner Gesamtheit zu erfassen. Um bessere Ergebnisse für bg-vorbehandelte Daten zu erzielen, haben wir eine quantisierte Normalisierung verwendet. Außerdem wurde in diesem Fall die Batch-Normalisierungstechnik erst nach der letzten dichten Schicht des Modells angewendet. Als Erweiterung der aktuellen Studie könnte ein Modell mit zwei Erkennungsstufen vorgeschlagen werden. Das erste Modell wäre für die Bestimmung des Probentyps zuständig, während das zweite Modell in der Lage wäre, die Prüfmuster in Unterklassen innerhalb der Probentypklasse zu unterteilen. Dieses Verfahren ist wesentlich zeitaufwändiger, dürfte aber zu besseren Ergebnissen führen. Ausgehend von den Ergebnissen der Diskriminierungsstudie, die alle 11 Klassen und einen Ansatz zur Datenerweiterung umfasst, kann die Verwendung einer Spektralsegmentierungsmethode als wertvolle Strategie zur Erhöhung der Vorhersagegenauigkeit des Modells angesehen werden.

5. Schlussfolgerung

Insgesamt können wir durch die Analyse der mit TEM-EDX und der auf Raman-Spektroskopie und DL-Algorithmen basierenden Methodik erzielten Ergebnisse argumentieren, dass diese Methoden erfolgreich für die Charakterisierung von ultrahohen Verdünnungen eingesetzt werden können. Diese Reihe von Techniken hat eine Modalität offenbart, die die Grundlage für die Unterscheidung verschiedener Heilmittel in Abhängigkeit von der Art der für die Herstellung der Heilmittel verwendeten Ausgangssubstanzen sein könnte oder die Differenzierung von Proben auf der Grundlage ihres Potenzierungsgrades ermöglichen könnte. Dieser Ansatz ermöglicht die Analyse stark verdünnter Lösungen in einem weitaus größeren Maßstab, als dies in der Vergangenheit möglich war.

CRediT-Beitragserklärung

Camelia Berghian-Grosan: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Schreiben – ursprünglicher Entwurf, Überwachung, Methodologie, Untersuchung, Datenkuration, Konzeptualisierung. Sahin Isik: Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, Schreiben – ursprünglicher Entwurf, Software, Methodologie. Alin Sebastian Porav: Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, Schreiben – ursprünglicher Entwurf, Methodologie, Untersuchung. Ilknur Dag: Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, Schreiben – ursprünglicher Entwurf, Überwachung, Methodologie. Kursad Osman Ay: Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, Schreiben – ursprünglicher Entwurf, Methodologie, Untersuchung. George Vithoulkas: Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, Schreiben – ursprünglicher Entwurf, Methodologie, Konzeptualisierung.

Erklärung über konkurrierende Interessen

Camelia Berghian-Grosan und George Vithoulkas berichten, dass die Kosten für die Veröffentlichung des Artikels von der International Academy of Classical Homeopathy übernommen wurden. George Vithoulkas berichtet über eine Beziehung zur Internationalen Akademie für Klassische Homöopathie, die Folgendes umfasst: Mitgliedschaft im Vorstand. Wenn es weitere Autoren gibt, erklären diese, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die den Anschein erwecken könnten, dass sie die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflussen.

Danksagung

Die Autoren danken der Internationalen Akademie für Klassische Homöopathie (I.A.C.H.) – Alonissos (Griechenland) für die Unterstützung dieser Forschung und Dr. Drosos Kourounis für seine Vorschläge und Korrekturen, die die Qualität dieses Manuskripts erheblich verbessert haben. Ein besonderer Dank gilt der Korres-Apotheke und Herrn George Korres (Griechenland, www.korres.com) für die Zubereitung der homöopathischen Lösungen.

Anhang A. Ergänzendes Material

Verfügbarkeit von Daten

Die Daten werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt.

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